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大肠菌群计数检验步骤

第一法大肠菌群MPN 计数
操作步骤
6.1、样品的稀释
6.1.1、 固体和半固体样品:称取25g 样品,放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8 00or/min-10 000r/min 均质1 min-2 min ,或放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的
无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1 min-2 min ,制成1:10 的样品匀液。
6.1.2、 液体样品:以无菌吸管吸取25ml样品,置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的
无菌玻璃珠)中,充分棍匀,制成1:10 的样品匀液。
6.1.3、 样品匀液的pH 值应在6.5-7.5 之间,必要时分别用1mol/L 氢氧化钠(NaOH )或1 mol/L 盐酸(HCI )调节。
6.1.4、 用1ml无菌吸管或
微量移液器吸取1:10 样品匀液1ml,沿管壁缓缓注人9ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1 支1ml无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1:100 的样品匀液。
6.1.5、 根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成10 倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次,换用1 支1ml无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15 min 。
6.2、 初发酵试验
每个样品,选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液(
液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1ml(如接种量超过1ml,则用双料LST肉汤), 36℃±1℃ 培养24h±Zh ,观察倒管内是否有气泡产生,如未产气则继续培养至48h±2h 。记录在24h 和48h 内产气的LST 肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性,产气者则进行复发酵试验。
6.3、 复发酵试验
用接种环从所有48h±2h 内发酵产气的LST 肉汤管中分别取培养物l环,移种于煌绿乳糖胆盐( BGLB)肉汤管中,36℃±1℃ 培养48h±2h ,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。
6.4、
大肠菌群最可能数(MPN )的报告
根据
大肠菌群阳性管数,检索MPN 表(见附录B ) ,报告每克(或毫升)样品中大肠菌群的MPN 值。

第二法
大肠菌群平板计数
8、 操作步骤
8.1、 样品的稀释
按6.1 进行。
8.2、 平板计数
8.2.1、 选取2 个~3 个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种两个无菌平皿,每皿1ml。同时分别取1ml生理盐水加人两个无菌平皿作空白对照。
8.2.2、 及时将15 mL-20ml冷至46℃ 的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA )约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3 mL-4mlVRBA 覆盖平板表层。翻转平板,置于36℃±l℃ 培养18h-24h 。
8.3、
平板菌落数的选择
选取菌落数在30-150 之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑
大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5 mm 或更大。
8.4、 证实试验
从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落,分别移种于BGLB 肉汤管内,36℃±1℃ 培养24h-48h ,观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。
8.5 、大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为
大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3 中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每克(或毫升)样品中大肠菌群数。

第三法
大肠菌群PetrifilmTM 测试片法
10、 操作步骤 10.1 样品的稀释
按6.1 进行。
10.2、 测定
10.2.1、 样品接种及培养
将待检样品选取2 个-3 个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种两张测试片。将PetrifilmTM
大肠菌群测试片置于平坦实验台面,揭开上层膜,用吸管吸取1ml样液垂直滴加在测试片的中央,将上层膜缓慢盖下,避免气泡产生和上层膜直接落下。把压板(平面底朝下)放置在上层膜中央,轻轻地压下,使样液均匀覆盖于圆形的培养面积上,切勿扭转压板。拿起压板,静置至少1 min 以使培养基凝固。将测试片的透明面朝上置于培养箱内,堆叠片数不超过20片,36℃±1℃ 培养24h±2h 。
10.2.2、 判读
培养24h±Zh 后应立即计数,可目测或用
标准菌落计数器、放大镜或PetrifilmTM 自动判读仪来计数。红色有气泡的菌落确认为大肠菌群。圆形培养区边缘上及边缘以外的菌落不作计数。当培养区域出现大量气泡,大量不明显小菌落或培养区呈暗红色三种情况,表明大肠菌群的浓度较高,需要进一步稀释样品以获得更准确的读数。
10.3、
大肠菌群测试片计数的报告
选取菌落数在15-150 之间的测试片,计数其红色有气泡的菌落数,两个测试片的平均
菌落数乘以稀释倍数即为每克(或毫升)样品中的大肠菌群菌落形成单位(CFU )数。如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15 ,则计数稀释度最低的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告;如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长,则以小于1 乘以最低稀释倍数报告;如果最高稀释度的菌落数大于150 ,计数最高稀释度的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告。计数菌落数大于150 的测试片时,可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数,换算成单个方格内的菌落数后乘以20 即为测试片上估算的菌落数(圆形生长面积为20cm2 , )。报告单位以CFU/g (或CFU/mL )表示。

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