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大肠菌群和粪大肠菌的检验

一、实验目的要求
1、 了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义。
2、 学习并掌握大肠菌群检验的原理和方法。
二、原理
大肠菌群系指一群能发酵乳糖,产酸产气,需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。一般认为该菌群细菌可包括:大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。该菌主要来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染,同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。
食品中大肠菌群数系以每100g(或ml)检样内大肠菌群最近似数(the most probable number-简称MPN)表示。
三、试剂和仪器
(一)最先准备的器材
规格名称 数量 用途
1、500ml广口瓶 1个 稀释样品
2、500ml三角瓶 2个 制生理盐水
3、250ml三角瓶 1个 制EMB琼脂
4、18×180mm试管 8支 稀释及制双料乳糖胆盐发酵管
5、18×150mm试管 20~25支 单料乳糖胆盐发酵管、乳糖发酵管
6、13×130mm试管 20支 制蛋白胨水、EC肉汤
7、1ml移液管 5 支
8、10ml移液管 3 支
9、直径为90mm平皿     12套  制EMB平板
10、250ml量筒 1支
(二)应灭菌消毒的器材
剪刀1把 开瓶器  不锈钢药匙1把 滴管胶头4只  称量纸适量
(三)应制备的培养基
培养基总量 所用容器
1、 0.85%NaCl生理盐水 300ml   500ml三角瓶
2、 乳糖胆盐发酵管 
双料: 10ml/支 5支 60ml 18×180mm试管(装有导管)
单料: 10ml/ 8支 90ml 18×150mm试管(装有导管)
3、 EMB琼脂: 1瓶 120ml 250ml三角瓶 
4、 乳糖发酵管: 3ml/支 5支 20ml 13×130mm试管(装有导管)
5、 EC肉汤: 3ml/支 6支 20ml 13×130mm试管(装有导管)
6、 蛋白胨水: 2ml/支 10支 20ml 13×130mm试管
四、实验内容
(第一天) 样品处理及初发酵接种:
所需培养基与器材:
u 培养基:
1. 0.85%NaCl生理盐水: 300ml 1瓶
2. 乳糖胆盐发酵管 
双料: 10ml/支 3~5支 18×180mm试管(有导管)
单料: 10ml/支 6~8支 18×150mm试管(有导管)
u 灭菌器材:
500ml广口瓶(内带5mm带玻璃珠) 1~2个
18×180mm试管 3支
250ml量筒 1支
1ml移液管 5 支
10ml移液管 3支
当样品袋装样品时:消毒酒精、棉花、无菌剪刀、称量纸、不锈钢药匙、橡皮胶头3只;
当样品瓶装样品时:石炭酸消毒纱布两块、开瓶器。
(一)、样品处理(无菌操作)
Ø 样品:瓶装饮料或酿造酒类:
用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌,用石炭酸纱布盖好,再用灭菌的开瓶器将盖打开,将含二氧化碳的样品倒入一信灭菌瓶内,加盖假盖,口勿盖紧,在其上覆盖在一块灭菌纱布,轻轻摇荡,待气体全部逸出后,妈样进行稀释。
Ø 乳制品:
袋装奶粉用75%的酒精棉球涂擦消毒袋口,以无菌操作取样,放入灭菌的三角瓶内,将225mL温热的灭菌生理盐水徐徐加入(先用少量生理盐水将奶粉调成糊状,再全部加入,以免结块)。
(二)、 检样稀释与乳糖胆盐发酵试验----[初发酵](无菌操作)
1、 用无菌量筒量取225mL灭菌生理盐水倒入灭菌玻璃瓶内,用10ml移液管吸取9mL生理盐水注入无菌试管中,共2支,备用。 
2、 以无菌操作将检样25mL(g)放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000~10000r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。
3、 用10ml移液管吸取1:10的稀释液10ml分别注入双料乳糖胆盐发酵管中:共3支。
4、 用1ml移液管吸取1∶10的稀释液1ml分别注入单料乳糖胆盐发酵管中:共3支。
5、 用同上一支1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内,换一支吸管,吸吹5次,或振摇试管混匀,做成1∶100的稀释液。再用这支吸管吸取1∶100稀释液1mL分别注入单料乳糖胆盐发酵管中:共3支。
² 注意:做10倍递增稀释时,每递增稀释一次,要换用1支1mL灭菌吸管。
² 放入培养箱培养:
将接种后的乳糖胆盐发酵管置36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气,则可报告为大肠菌群阴性;如有产酸产气者(培养液由紫蓝色变成黄色并有气泡),则按下列程序进行试验。
(第二天)进行EMB平板分离,[EC肉汤、蛋白胨水接种(粪大肠菌群检验)]:(无菌操作)
所需培养基与器材:
u 培养基:
1. EMB琼脂平板 5只
2. EC肉汤: 5支
3. 蛋白胨水: 5支
u 器材:
44.5±0.2℃水浴箱,接种环。
(一)、接种EMB平板进行分离培养
将产气的发酵管分别转种在EMB琼脂平板上(一管对一个平板),置36±1℃温箱内,培养18~24h,然后取出,观察菌落形态,并挑取可疑菌落做:革兰氏染色和证实试验。
在EMB平板上的典型菌落:呈紫黑色,圆形,边缘整齐,表面光滑湿润,常有金属光泽。由于药物影响,亦呈现紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、湿润等,常为大肠杆菌,均应注意挑选。
(二)、接种EC肉汤(用于粪大肠菌群检验)
用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物转种于EC肉汤管内(一管对一个管),置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±2h。经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告:为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃培养18~24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。
(三)、接种蛋白胨水:(用于粪大肠菌群检验)
用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物转种于蛋白胨水内(一管对一个管 ),置44.5±0.2℃水浴箱内,培养24±2h。同时取一蛋白胨水培养基不接种,一起培养做对照试验。
(第三天)进行乳糖发酵(证实试验)接种、镜检、靛基质试验、观察EC肉汤发酵结果
所需培养基与器材:
u 培养基:
1. 乳糖发酵管:5支
2. 靛基质试剂、(欧—波试剂)
3. 革兰氏染色液
u 器材:显微镜
(一)、乳糖发酵接种
  在EMB平板上的典型菌落:呈紫黑色,圆形,边缘整齐,表面光滑湿润,常有金属光泽。由于药物影响,亦呈现紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、湿润等,常为大肠杆菌,均应注意挑选
从EMB平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1~2个同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。
(二)、进行镜检
从EMB平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1~2个进行革兰氏染色。大肠菌群菌:革兰氏染色阴性无芽胞短杆菌。
(三)、进行靛基质试验
向培养后的蛋白胨水中沿管壁加入靛基质试剂(欧—波试剂)0.5mL,静置片刻,观察液面。阳性反应者,液面呈玫瑰红色;阴性反应液面呈试剂本色。则证实为粪大肠菌群阳性。
(四)、观察EC肉汤发酵结果
如所有EC肉汤管均不产气,则可报告:为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃培养18~24h,凡平板上有典型菌落者,则证实:为粪大肠菌群阳性。
(第四天)观察乳糖发酵结果及器材的消毒和清洗
(一)、观察乳糖发酵结果
观察:乳糖发酵管内是否有气体产生
u 凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。
(二)、查表报告结果
  根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。
根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值。

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